无供体高效插入大片段序列，武大殷昊团队开发新型基因编辑系统，正在进行小鼠试验丨专访
CRISPR/Cas9 被视为当前最为高效，便捷、应用最广泛的基因组编辑方法之一。不过，CRISPR/Cas9 系统真正广泛应用于临床治疗中，还需要解决长片段插入和有效递送等问题。
近日，武汉大学殷昊团队开发出了一种新型基因编辑系统 ——GRAND editing。在研究中，他们证明无需 DNA 供体即可在基因组中高效插入大片段 DNA 序列。相关研究已发表在 Nature Methods 上。
（来源：Nature Methods）
GRAND 由一对先导编辑指导 RNA（pegRNAs）组成，其中逆转录酶模板（RTT）与目标位点非同源，但相互互补，可通过 DNA 逆转录过程高效靶向插入 20-250 bp 大小的基因片段，并能够插入最长约 1000 bp 的大小。值得一提的是，GRAND 系统在非分裂细胞中也表现出了较高的插入效率。
研究显示，当插入片段大小为 150 bp，精准插入效率可达约 60%，当片段为 250 bp 时，插入效率也高达约 30%，并且此方法所产生的副产物很低，并检测不到脱靶。
“我们希望开发出可以同时兼顾效率和安全性的基因编辑工具，既能够在基因组中插入 kb 级基因片段，编辑效率也可以达到 30%-50%，通常靶向插入效率达到 50% 基本可达到治疗大部分遗传病的目的。同时，我们目前正在推进 GRAND 在小鼠动物模型的试验，验证其治疗潜力。” 殷昊说。
图 | 武汉大学医学研究院、中南医院医学研究院、教育部免疫和代谢前沿科学中心教授殷昊（来源：受访者提供）
殷昊曾在美国麻省理工学院 Robert Langer 和 Daniel Anderson 实验室从事博士后研究，并于 2018 年回到武汉大学成立实验室开展研究。他现在是武汉大学医学研究院、中南医院医学研究院、教育部免疫和代谢前沿科学中心教授，此前作为科学创始人联合创办基因编辑疗法公司正序生物。
“利用基因编辑工具治疗疾病存在两大难点，一是如何在体内靶向插入长片段序列，二是如何高效将基因编辑系统递送到体内。” 殷昊说。他实验室的研究主要围绕新型基因编辑工具和递送系统两个方向展开，包括开发可高效靶向插入长片段的基因编辑工具，以及靶向肝脏和靶向肝外 LNP 等递送载体。
无供体插入长片段序列，暂未发现脱靶效应
2019 年，刘如谦开发出先导编辑器 PE，该系统主要由两部分组成，一部分是 Cas9 切口酶（Cas9 nickase）与逆转录酶（RT）的融合蛋白，另一部分是向导 RNA——pegRNA；2021 年 12 月，刘如谦更新优化了 PE，开发出 “升级版” 的新型基因编辑器 —— 双 prime editing (twinPE)。
Cas9 nickase 是一种突变版本的 Cas9，这种酶只会切割与 gRNA 结合的 DNA 单链。
需要说明的一点是，PE 可有效地插入约 44 bp 的片段，但不能插入数百乃至数千个碱基 DNA 片段；twinPE 系统则通过两个相邻 PE 可在基因组特定位点引入更大片段 DNA 序列。具体来说，该系统中引入了一种位点特异性整合酶（SSR），先利用 pegRNA 插入整合酶识别位点，再利用整合酶插入特定序列，可在特定位点插入长达 40 kb 大小的 DNA 序列，插入效率约为 9.6%。
“twinPE 系统采用了两步法插入 DNA 片段，整体插入效率约为 10%。GRAND 系统同样采用了 PE 系统中的 Cas9 RT 酶，不过工作机制有所区别。” 殷昊说。
GRAND 系统由一对 pegRNA 系统组成，逆转录出来的 ssDNA（单链 DNA）通过互补端相互结合，然后通过 Flap 交换插入 DNA 序列，其与 pegRNA 的目标序列不同源。
图 | 左为 PE3 系统，右为 GRAND 系统（来源：上述论文）
正是由于 GRAND 系统利用了逆转录出 DNA 单链形成互补序列、无需同源重组酶修复这一机制，GRAND 系统并不依赖于细胞周期即可实现高效定点插入编辑。这也使 GRAND 系统在非分裂细胞中表现出了高效的插入效率。
图 | GRAND 系统在各种细胞系和非分裂细胞中靶向插入大 DNA 片段（来源：上述论文）
考虑到，基因编辑工具以 mRNA 的形式递送到靶器官或靶细胞中，能够在细胞内瞬时高效表达。相比于 DNA 和蛋白质递送形式，不但能够提高编辑效率，而且能够显著降低基因组插入风险和脱靶效率，具有显著优势。
GRAND 系统将采用 LNP 递送载体，通过将 Cas9-RT 和 pegRNA 以 RNA 形式递送，进入细胞后再翻译。这就将 DNA 模板和 Cas9 核酸酶的递送转化成了 RNA 方式的递送，可行性更高、技术也更为成熟。“包裹 RNA 的 LNP 可以通过细胞内吞作用进入体内，之后溶酶体会释放 RNA。这种方式无需 DNA 供体即可实现基因编辑治疗，在治疗上非常具有优势。”
接下来，为了评估 GRAND 系统的安全性，团队进行了脱靶分析。初步分析发现，在研究中，利用此方法产生的副产物很少，并且没有检测到脱靶现象。团队还表示后续将会继续进行基因组分析检测脱靶问题。
紧接着，他们通过设计不同的向导 RNA 在多种人细胞系的不同位点（包括 FANCF、 HEK3、 PSEN1、 VEGFA、 LSP1 和 HEK4）检测插入效率。研究表明，当插入 150 bp 片段时，插入效率约 60%；当片段为 250 bp 时，插入效率约 30%；总体来说，GRNAD 系统允许最多插入约 1 kb 大小的 DNA 片段，不过前该工具对 > 400 bp 的片段效率还比较低。
“GRAND 系统在插入 1 kb 等大片段 DNA 序列时效率还不高，我们正在进一步改进该系统。下一步，希望能实现插入片段长度和效率的协同。” 殷昊说。
正在推进临床前动物试验
在研究中，殷昊团队初步在多种细胞系中对 GRAND 系统进行了概念验证和探索。据悉，该团队目前已经递交了 GRAND 系统及其递送系统的相关专利申请。
对于 GRAND 的转化工作，殷昊团队也有自己的考量。“现在，我们的主要任务是在实验室中继续优化 GRAND 系统并进一步验证其安全性和有效性，评估 GRAND 转化的可行性。如果动物试验中的相关数据表现出治疗相关疾病的潜力，转化是水到渠成的事情，转化工作也会更具有优势。”
殷昊告诉生辉，如果要真正达到转化阶段，还需要扩大插入的基因片段大小，从现在的 250 bp 达到高效插入 500 bp-1 kb 水平，这样可以使得临床使用范围更为广泛；另一方面，还需要考虑能否开发出高效递送的工具。（bp 表示碱基对，kb 表示千碱基对）
递送工具开发是殷昊实验室的另一个重点研究方向。他在 Robert Langer 实验室从事博士后研究期间，首次使用 LNP 体内递送 Cas9 mRNA，实现了体内基因修复和高效的基因敲除。
（来源：Nature Reviews Genetics）
在人体多种细胞系里面进行试验后，下一步，殷昊团队计划在多种动物模型中验证用 LNP 包裹 GRAND 的效果。“我们正在实验室推进小鼠试验了，获得更多安全性和有效性数据。” 殷昊说。
http://html.rhhz.net/YXXB/html/20201111.htm https://www.nature.com/articles/s41592-022-01399-1 https://www.nature.com/articles/nrg3763